实验指南：双荧光素酶实验

想验证miRNA与靶基因的作用? ——双萤光素酶报告基因检测

想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作?——双萤光素酶报告基因检测

想知道转录因子对下游基因的作用? ——双萤光素酶报告基因检测

没错，双萤光素酶体系就是这么的强大!

双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。今天，我们就来重点聊聊这个话题。

双萤光素酶实验的原理

　　将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。

萤光素酶实验具体有哪些应用？

   　1、验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

　　2、验证microRNA同lncRNA靶向互作。将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，检测荧光素酶活性。

　　3、启动子结构分析。将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。

　　4、启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

　　5、验证信号通路是否激活。将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。

双萤光素酶实验的具体步骤

　　1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。

　　2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

　　Luciferase活性测定：

　　（1）初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。

　　（2）加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。

　　（3）配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。

　   （4）测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。

　　（5） 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

实验注意事项

1、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性可以采取适当分装后避光保存的方法，以免反复冻融和长时间暴露于室温。

2、为取得***检测效果，同一批样品***保证相同的测定时间，通常为10 s。