实验指南：免疫共沉淀实验原理及详细步骤

研究蛋白之间相互作用必不可少的实验是免疫共沉淀(CoIP)，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分，因其具有可信度高的优点，在现在基础医学研究中广泛应用，本文将为您详解CoIP的实验原理和操作步骤，实验刚入门的同学必看哦。

实验目的

（1）检测两种目标蛋白是否在体内相互作用;

（2）找到与目标蛋白在体内存在相互作用的新蛋白。

实验原理

CoIP是利用抗原蛋白和抗体的特异性结合、以及“Protein A/G"特异性地结合抗体(免疫球蛋白)FC段的现象开发出来的方法。

目前多用Protein A/G预先结合在Argarose Beads上，使之与含有抗原蛋白的溶液(如细胞裂解液)及抗体(诱饵蛋白X抗体)反应后，Beads上的Prorein A/G就能通过抗体吸附诱饵蛋白X，诱饵蛋白X通过与靶蛋白Y相互作用将其从细胞裂解液中分离出来，从而达到免疫共沉淀的目的。　 

实验材料

细胞、RIPA缓冲液(RIPA buffer)、偶联有Protein A/G的免疫磁珠(Protein A/G Beads)、诱饵蛋白X与靶蛋白Y的抗体、IgG对照抗体、移液枪、4度冰箱以及低温离心机等。

实验步骤(不同实验室略有差异)

1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。

2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。

3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。

实验心得体会

你可能做了很多Co-IP实验，经常遇到的问题是检测不到与诱饵蛋白X相互作用的靶蛋白Y，或者检测得到的信号太弱。你是否也遇到过呢?别急，小编贴心总结来了!

　　出现以上问题的原因可能有：

　　1)裂解液中的去垢剂过于剧烈;

　　2)蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或者不稳定。

　　通常的解决办法如下：

　　1)降低去垢剂浓度或者更换去垢剂种类(SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS);

　　2)选择亲和力高的抗体以捕获更多的诱饵蛋白X从而捕获更多的相互作用蛋白;

　　3)通过细胞转染过表达的方式提高诱饵蛋白X的含量;

　　4)加入化学交联剂，增强诱饵蛋白X与相互作用蛋白的结合;

　　5)选择诱饵蛋白X或者相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。