载体构建(vector construction),为把DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。在基因工程中,常用人工构建的质粒(plasmid)作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒,导入到受体中(如细胞、菌体等),发挥某种功能。
津科生物构建载体的服务类型包括:CRISPR/Cas9基因敲除载体、microRNA过表达载体、shRNA干扰载体、报告基因载体、定点突变载体、基因亚克隆载体等。
服务流程
(1)载体选择
根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
(2)引物设计
引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接。
(3)PCR扩增
以cDNA为模板,PCR扩增目的基因,在引物两端分别引入酶切位点,1%琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带(1794bp)。
(4)载体和目标片段的限制性酶切
质粒载体和目的基因PCR产物双酶切,酶切反应在37℃水浴反应2h;1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx-DsRed-monomer-C1酶切大片段和目的基因酶切片段。
(5)连接转化
质粒酶切回收大片段与目的基因连接,连接反应在16℃反应12小时。取10ul连接产物与感受态细菌混匀后冰浴30min,42℃热激90s,立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基, 37℃恒温摇床培养50min,吸取 200ul的菌液,用移液器混匀后均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上, 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
(6)挑取克隆提质粒验证
挑取5个单菌落接种于含5ml,100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中,300rpm,37℃恒温摇床培养过夜,对过夜的菌液进行扩增,选择阳性菌液,用质粒小量提取试剂盒提取质粒,再进行测序验证。
酶切图谱
测序图谱
客户提供 | 有模板时:基因序列、测序结果、载体以及克隆位点等信息; |
无模板时:基因序列(Gene ID或基因名以及种属)、载体以及克隆位点等信息; | |
如是载体改造需提供详细的实验方案或线路图。 | |
最终交付 | 约4 µg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA; |
含有重组质粒的穿刺菌一管(TOP10); | |
发货文件主要包括如下内容:测序结果、COA报告、sqd文件 |