彗星实验(Comet assay)也被称为单细胞凝胶电泳实验(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的技术。当各种内源性和外源性 DNA 损伤因子诱发细胞 DNA 链断裂时,其超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到电解液中,而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。电泳过程中,如果DNA没有损伤,则将停留在原位,染色后呈圆形的荧光团,无拖尾出现。如果DNA受损,断裂的碎片进入到凝胶中,在电场的作用下,DNA碎片离开原位向阳极迁移,形成拖尾。DNA受损越严重,断裂越多,产生的碎片就越多、越小,则向阳极迁移的DNA碎片量就越多,迁移距离也越长,荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。
实验流程
收集细胞-铺胶-裂解-解旋-电泳-染色-观察结果
1. 制备单细胞悬浮液,在 37℃ 条件下,悬浮液与低熔点琼脂糖(LM琼脂糖)混合;
2. 将琼脂糖、细胞混合物涂布在预处理的载玻片上;
3. 4℃条件下用裂解液处理30-60min或过夜,裂解液由去垢剂及高盐溶液组成,可去除多余的细胞膜及组蛋白;
4. 将载玻片浸入电泳溶液中;
5. 进行凝胶电泳,随后,中和载玻片,待LM琼脂糖完全干燥后,用荧光染料染色,并于荧光显微镜下观察DNA损伤程度。
注:最常用的荧光染料是SYBR Gold,但荧光染料的观察需要荧光显微镜。如果选择银染,使用标准的光学显微镜观察即可。
提供至少5*105细胞量,4度运输