免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

实验流程

切片脱蜡至水-抗原修复-3%的双氧水处理-画圈-血清封闭-一抗4℃过夜孵育-二抗室温孵育-显色-苏木素染核-脱水、透明、封片-镜检

实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭）

5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。

7、 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

9、脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min--85%酒精5min --无水乙醇Ⅰ 5min --无水乙醇Ⅱ 5min--正丁醇5min--二甲苯Ⅰ 5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

10、显微镜镜检，图像采集分析。

案例：实验结果展示

结果判读

苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。

送样运输要求

1)石蜡切片制片，组织取样后应立即放入固定液中，避免冻存;

2)冰冻切片制片应取用新鲜组织，以免抗原丢失;

3)组织蜡块可以保存很长时间，但是石蜡切片理论上不能超过半年。冰冻切片不能超过3个月

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