蛋白质免疫印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的目的蛋白的方法。该方法包括三个部分：（1）SDS-PAGE凝胶电泳；（2）蛋白质的电泳转移；（3）免疫印迹分析。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白质分析领域的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定目的蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

实验流程

实验步骤

1. 获取细胞或组织裂解物；

2. 蛋白质定量：常用的蛋白定量方法：CCK-8，Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，或者直接进行电泳分离蛋白；

3. 电泳分离蛋白质；

4. 转膜：根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率***；

5. 封闭：去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS；

6. 孵育一抗：一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键；

7. 孵育二抗：根据说明书推荐浓度使用TBST稀释。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索***稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时；

8. 底物孵育：选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量；

9. 结果分析和检测：凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片。

案例：实验结果展示

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1.BCA蛋白定量示例图

2.WB结果示例合成图

客户提供

1. 足够量的生物样品，有具体要求请事先说明；

2. 适合的一抗，如需我们采购请事先说明；

3. 相关背景资料等。

注意事项

1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定***条件。

2. 显色液必须新鲜配置使用，***加入H₂O₂。

3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

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