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Western Blot(蛋白质免疫印迹)

技术介绍


蛋白质免疫印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的目的蛋白的方法。该方法包括三个部分:(1)SDS-PAGE凝胶电泳;(2)蛋白质的电泳转移;(3)免疫印迹分析。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白质分析领域的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定目的蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。


实验流程


 


实验步骤


1. 获取细胞或组织裂解物;

2. 蛋白质定量:常用的蛋白定量方法:CCK-8,Bradford assay, Lowry assay BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,或者直接进行电泳分离蛋白;

3. 电泳分离蛋白质;

4. 转膜:根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDFNC膜的使用频率***;

5. 封闭:去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有含BSA或者脱脂奶粉的TBSTTBS

6. 孵育一抗:一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键;

7. 孵育二抗:根据说明书推荐浓度使用TBST稀释。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索***稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时;

8. 底物孵育:选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量;

9. 结果分析和检测:凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片。


案例:实验结果展示


1.BCA蛋白定量示例图

 

 

                                      

  

                                                                           

                           

                       

 

 

2.WB结果示例合成图

 

 

 


客户提供


1. 足够量的生物样品,有具体要求请事先说明;

2. 适合的一抗,如需我们采购请事先说明;

3. 相关背景资料等。


注意事项


1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定***条件。

2. 显色液必须新鲜配置使用,***加入H2O2

3. DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。


 

 


Western Blot(蛋白质免疫印迹)
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