蛋白质免疫印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的目的蛋白的方法。该方法包括三个部分:(1)SDS-PAGE凝胶电泳;(2)蛋白质的电泳转移;(3)免疫印迹分析。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白质分析领域的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定目的蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。
1. 获取细胞或组织裂解物;
2. 蛋白质定量:常用的蛋白定量方法:CCK-8,Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,或者直接进行电泳分离蛋白;
3. 电泳分离蛋白质;
4. 转膜:根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率***;
5. 封闭:去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS;
6. 孵育一抗:一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键;
7. 孵育二抗:根据说明书推荐浓度使用TBST稀释。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索***稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时;
8. 底物孵育:选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量;
9. 结果分析和检测:凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片。
1.BCA蛋白定量示例图
2.WB结果示例合成图
1. 足够量的生物样品,有具体要求请事先说明;
2. 适合的一抗,如需我们采购请事先说明;
3. 相关背景资料等。
1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定***条件。
2. 显色液必须新鲜配置使用,***加入H2O2。
3. DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。