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BrdU染色

技术介绍


BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,***用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。

 

胸苷及其类似物5'-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)的化学结构。 除了胸苷碳残基5上的甲基(蓝色突出显示)被溴取代(绿色突出显示)(Kolb et al. 1999)以外,两者结构是相同的。


实验步骤


(1)细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1d,用含0.4%FBS培养液同步化3d,使绝大多数细胞处于G0期。

(2)加入BrdU(储液:1.0 mg/ml,终浓度为0.03μg/ml),37℃,孵育40min。

(3)弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。

(4)甲醇/醋酸固定10min。

(5)经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。

(6)5%正常兔血清封闭。

(7)甲酰胺100℃,5 min变性核酸。

(8)冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。

(9)按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。


案例:实验结果展示


左边是BrdU处理的脾脏,右边是正常脾脏,显棕色信号的细胞BrdU染色后新生细胞