三磷酸腺苷酶水解三磷酸腺苷和磷酸,并放出能量。磷酸和钠离子结合,在酶活性处形成无色的磷酸钙,磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴,再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。用碱作前孵育处理时,仅白肌纤维出现阳性反应,这对肌球蛋白ATP酶来说是特异性的。
冰冻切片入水-ATP染色-脱水封片-显微镜镜检。
1、未经固定的新鲜组织冰冻切片自然晾干,组化笔画圈圈住组织,滴加PH10.4的孵育液孵育5min,倾去孵育液,不水洗直接滴加PH 9.4的孵育液孵育30 min,室温下进行并加盖。
2、倾去孵育液,切片直接依次入3缸CaCL2溶液浸染,每次2min。
3、切片直接入硝酸钴溶液浸染5min,5缸自来水浸洗,每缸20s。
4、现配1%硫化铵溶液(先取5ml纯水,再用巴氏吸管取1滴浓的硫化铵溶液加入,混匀即可,配好后立即使用)滴染或浸染30s,3缸自来水浸洗,每缸20s。
5、切片依次入无水乙醇I 5min -无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min -二甲苯透明5min ,中性树胶封片。
6、显微镜镜检,图像采集分析。
Ⅰ型肌纤维呈浅灰色或无色,Ⅱ型肌纤维呈深灰色或黑色。
新鲜组织干冰运输,冰冻切片
1、切片一定要是新鲜组织的冰冻切片,不可以固定。
2、Tris碱、氯化钙粉剂常温保存,硫化铵常温避光保存,ATP钠盐-20℃保存,其它染液4℃
保存,使用前先复常温。
3、工作液和1%硫化铵溶液要现配现用,不能保存。