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流式细胞周期
技术介绍
流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的原理：由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI(碘化丙啶)为插入性核酸荧光染料，能选择性嵌入核酸DNA和RNA双螺旋的碱基之间与之结合，结合量与DNA的含量成正比关系，其荧光强度直接能反映细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。
实验步骤
1、收集细胞：弃去上清，加入1 ml PBS清洗一次，弃上清，再加入1 ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1500 rpm离心5 min收集细胞。
2、PBS洗涤细胞：加入3 ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。
3、固定过夜：沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75%乙醇，重悬细胞，4℃过夜。
4、PBS洗涤细胞：加入2 ml PBS混匀后，1500 rpm离心5 min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100 ul PBS重悬细胞。
5、去除RNA：加入2μl 浓度为1mg/ml 的RNaseA(去离子水配制)，37℃水浴40min。
6、荧光标记：加入100 µl浓度为100 µg/ml 的PI染色液(PBS配制)，避光染色20min。
7、上机检测：流式细胞仪使用激发波长488nm，发射波长585±21nm进行检测，用Modfit 软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。
流式细胞周期结果展示
huh7细胞