条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出floxed小鼠, 该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前,该目的基因表达完全正常,而当该floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,可以 在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其它组织或细胞表达正常。
1、用于具有胚胎致死性目的基因的研究;
2、用于研究基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能;
3、与控制Cre或Flp表达的其它诱导系统相结合,还可以对某一基因的表达同时实现在时间和空间两方面的调控。
1、嵌合体小鼠鉴定:通过毛色判断嵌合体(黑白相间) ,黑色占的比例越大,嵌合率越高。
2、去除抗性基因 Neo:嵌合体小鼠和全身表达Flp deleter小鼠杂交,PCR鉴定,获得去掉打靶载体中的 Neo 基因的F1 代(杂合子);
3、挑选一对F1 代小鼠进行自交,通过 PCR 鉴定筛选得到去除Frt两个位点片段纯合子的 F2代小鼠(命名:geneflox/ flox)。
备注:geneflox/ flox 两条染色体上都带有 loxp–gene-loxp 的模型。
**PCR 鉴定引物设计原则:根据Frt 前后及3’arm序列设计鉴定引物鉴定Neo是否去除;根据LoxP前后设计引物鉴定LoxP。
4、组织特异性敲除模型: Geneflox/ flox 小鼠与组织特异性Cre小鼠杂交, PCR 鉴定,得到敲除 gene 的杂合子F3 代小鼠;
5、挑选一对F3 代小鼠进行自交, 通过 PCR 鉴定筛选得到去除 gene 纯合子的 F4 代 cKO 小鼠。
**PCR鉴定引物设计原则:根据cKO region前5’arm及3’arm基因序列设计鉴定引物鉴定是否敲除。