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TUNEL(白光)检测

技术介绍


晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下,将带有生物素(Biotin)分子的dUTP,标记到DNA的3'-末端,随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合,***通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞,这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。


实验流程


脱蜡至水--蛋白酶K修复--破膜通透--孵育tunel反应液--孵育POD反应液-- DAB显色--苏木素染核--脱水封片--镜检拍照


实验步骤


1.石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2.修复:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织,37度温箱孵育20min。将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

3.(可选步骤)破膜:切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育20min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

4. 阻断内源性过氧化物酶:将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片放入3%双氧水溶液,室温避光孵育20 min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

5.室温平衡:切片稍甩干后在圈内滴加buffer覆盖组织,buffer常温孵育10min.

6.加反应液: 去掉平衡液,Recombinant TdT enzyme:Biotin-dUTP Labeling Mix:Equilibration Buffer=1 µL:5 µL:50 µL比例混合,加到圈内覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃温箱孵育1小时,湿盒内加少量水保持湿度。

7.加Streptavidin-HRP反应液:将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。 Streptavidin-HRP和TBST按1:200比例混合,加到圈内覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃温箱孵育30min。将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

8. DAB显色:切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为细胞核呈棕黄色,纯水冲洗切片终止显色。

9. 复染细胞核:苏木素复染1min左右,纯水洗涤,分化液分化数秒,纯水洗涤,氨水返蓝,纯水冲洗。

10. 脱水封片:将切片经4缸100%酒精脱水,每缸5min, 随后在正丁醇中浸泡5min,放入二甲苯中进行透明,时间5min以上,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。


案例:实验结果展示


 


结果判读


苏木素染细胞核为蓝色,DAB显出来的阳性凋亡细胞核为棕黄色


送样运输要求


石蜡切片常温、冰冻切片-20℃、固定后细胞爬片4℃


TUNEL(白光)检测
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