微生物多样性测序是对环境样品中的DNA进行特定长度的PCR产物进行测序的分析。细菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的扩增子测序能同时对优势物种、稀有物种和一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况。是当前对环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段。

细菌微生物多样性

16S rDNA测序：16S rDNA为编码原核核糖体小亚基 rRNA的DNA序列。具有10个保守区和9个高变区。保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区反映物种间的差异。对16S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境微生物中的群落结构多样性。

16S rDNA序列及常用扩增引物序列

真菌微生物多样性

18S rDNA测序：18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。18S rDNA也包含可变区和保守区。对18S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。

ITS1测序：ITS分为两个区域：ITS1和ITS2。ITS区域进化速率是18S rDNA的10倍之多。对ITS1和ITS2进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。

ITS rDNA序列及常用扩增引物序列

功能基因多样性

功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化细菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌等。功能微生物在分类学上可能有很大的不同，但却具有相似的基因使其能够发挥同样的功能，因此使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如AOA、AOB、nifH等。

功能基因测序，作为一类特殊的微生物扩增测序项目，是根据复杂环境中具有特殊功能的微生物基因序列设计引物，用该引物进行PCR扩增，建库后进行高通量测序。功能基因测序可有效研究特定环境中的功能微生物物种信息，包括：功能微生物功能差异、分类和丰度等，并与每个采样点的环境因子相结合，可以同时分析环境因子与功能细菌群落结构的关系，因此对复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。

技术路线

送样要求

（1）DNA送样要求

DNA浓度 ≥10ng/μl（Qubit），DNA质量≥500ng（Qubit），DNA电泳条带清晰，无降解或者轻度降解。

（2）环境样品取样方法及送样要求

粪便：清晨采集新鲜粪便样品，放于无菌离心管或其它无菌容器中，样品带回实验室后分装至无菌离心管或冻存管中，每份样品5g左右即可，液氮速冻3-5min，-80°C长期保存，干冰运输送样。

肠道内容物：无菌条件下对动物个体进行处理，用75%酒精擦拭体表，用无菌解剖剪剪开动物腹部，取出胃肠道等目的器官，用PBS进行清洗，离心收集沉淀，分装于2 mL离心管中；迅速置于液氮中冷冻 3~4 小时，然后转移至-80°C 或液氮中长期保存，干冰运输。

土壤：选取采样地点，可多点采样法进行取样，除去土壤表层未分解的凋落物层，采集土壤5g左右；样品带回实验室后过2mm 筛后；分装至无菌EP管或冻存管中，迅速置于液氮中冷冻 3~4 小时，然后转移至-80°C 或液氮中长期保存，干冰运输。

污泥：选取污泥样本于无菌离心管或其它无菌容器中，样品带回实验室后分装至无菌离心管或冻存管中，每份样品5g左右即可，液氮速冻3-5min， -80°C长期保存，干冰运输送样。

水体：对于水质较为清澈（目测）的或微生物含量极其稀少的水样如：自来水、井水、泉水等，用采集回来的水样样品 1L 通过 0.22μm 的微孔滤膜真空过滤，水样中的总微生物被富集在滤膜表面，滤膜与无菌管中，液氮速冻，干冰运输。

发酵液：对于水质较为混浊的（或微生物含量较为丰富的发酵液）水样，三点水样混合摇匀后取80mL分装在两个无菌的50mL的离心管，每个分装40mL，防止分装过满，水样冰冻后体积膨胀，导致离心管破裂，被其它微生物群体污染。液氮速冻3-5 min，-80℃保存。

皮肤：采用无菌棉签或无菌手术刀片轻轻刮取皮肤表面取样，取样后将棉签置于无菌的离心管，液氮速冻，-80℃长期保存；如果研究正常情况下皮肤微生物，取样前24h不能洗澡，不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等。

结果展示

（1）物种注释

根据97%的相似度进行OTU聚类后，基于Silva（细菌）和UNITE（真菌）分类学数据库对OTU进行分类学注释，得到每个OTU对应的物种分类信息，进而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）统计各样品群落组成，绘制样品在各分类学水平下的群落结构柱状图，柱状图展示不同样品中物种的组成和相对丰度。

（2）主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）

PCA是一种分析和简化数据集的技术，通过将方差进行分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，通过分析不同样品 OTU（97%相似性）组成可以反映样品的差异和距离，PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够***反映方差的两个特征值。图中两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。

（3）LEfSe分析

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析主要用于发现不同组间具有统计学差异的Biomarker，根据设定的Biomarker筛选标准（LDA score>4）找出符合条件的Biomarker。

（4）16S功能预测

16S功能预测基于PICRUSt软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异。